Perifériás mononukleáris sejtek (PBMC) izolálás és fagyasztás protokoll
Hematológiai automata (Sysmex) segítségével meghatározzuk a vérminta sejtes összetételét (fehérvérsejt (WBC), vörösvérsejt (RBC), vérlemezkék (PLT), limfocita (LY), neutrofil granulocita (NEU)). A mintát háromszorosra hígítjuk PBS (Gibco)-EDTA pufferrel (2mM EDTA, Invitrogen). A fehérvérsejteket Ficoll-grádiens centrifugálással különítjük el a granulocitáktól illetve a vörösvértestektől, ezért rárétegezzük a pipettával kimért Ficoll (GE HealthCare, Merck Life Science) oldatra az izolálni kívánt mintát (15 ml Ficoll + 30/35 ml hígított minta), majd centrifugáljuk: 30 perc, 400 g, fék kikapcsolva. Ezt követően a Ficoll oldat felett kialakult vékony PBMC réteget pipettával óvatosan leszívjuk egy steril üres csőbe, PBS-EDTA pufferrel mossuk, majd ismét centrifugáljuk 10 percig, 300 g fordulatszámon.
Egy csőbe összegyűjtjük a 20 ml PBS-EDTA-ban felvett pelleteket, majd össztérfogatot mérünk és 1 ml mintát Sysmex illetve FACS mérésre kipipettázunk. A mintából újabb sejtszámolást hajtunk végre. A maradék sejtszuszpenziót kiegészítjük PBS-EDTA-val olyan módon, hogy utána a fagyasztási sejtszámok és térfogatok egyszerűen kihígíthatóak legyenek. Ezután megismételjük a centrifugálást 10 percig, 300 g fordulattal. A csövekről leöntjük a felülúszót, majd fellazítjuk a pelletet és megfelelő mennyiségű fagyasztó médiumot (50 % fötális borjú szérum, FBS good, PAN Biotech; 40% RPMI alap médium, Gibco; 10% DMSO, Miltenyi) pipettázunk a sejtekre. A sejtszuszpenziót 1 ml-es adagokban fagyasztjuk le és -80 °C-on tároljuk maximum 2 napig, majd folyékonynitrogén tárolóba helyezzük.
A korábban kivett mintát FACS segítségével karakterizáljuk CD3, CD4, CD8, CD20, CD14, CD56 sejtfelszíni markerekkel való jelölés után.
Limfocita populáció meghatározás áramlási citometriás mérés (FACS) segítségével
Áramlási citométerrel mért felhőkép (Plot) kielemzésének módja
A PBMC mintában méret – FSC – és granuláltság – SSC – szerint választottuk külön az egyes populációkat. Jól látható három sejtcsoport elkülönülése: ahol a PLT rövidítés jelöli a vérlemezkéket (trombocita), amelyek a legkisebb méretűek és sejtmag nélküliek, így a granuláltságuk is a legalacsonyabb, az MO jelöli a monocitákat, amelyek méretre a legnagyobbak és sejtmaggal rendelkeznek. Végül a számunkra fontos populációt az LY, mint limfocita rövidítés jelöli. Ezek a sejtek átlagosan 6-7 mm nagyságúak, így a többi sejtekhez képest közepes méretűek.
CFSE festési protokoll
A CFSE festés elméleti háttere
A CFSE (Invitrogen) mint rövidítés a karboxifluoreszcein-diacetát-szukcinimidil-észter nevű festéket takarja. CFSE-re nézve a sejtek membránja áteresztő, így az bejut a citoplazmába és ott egy enzimreakcióban levágódik róla az acetát csoport, az így visszamaradt molekula viszont már nem képes átjutni a membránon, becsapdázódik a citoplazmában és stabilan jelöli a sejteket. A sejtek osztódásakor a CFSE-t tartalmazó citoplazma egyenlő arányban oszlik meg a leánysejtek között, így a CFSE festés intenzitása minden sejtosztódással feleződik. Ezért ha detektáljuk, hogy a sejtek hány százalékában csökkent a CFSE jelintenzitása a kiindulási értékhez képest, akkor megkapjuk az osztódáson átesett sejtek arányát/számát .
CFSE festési protokoll
Fagyasztásból felvett PBMC sejteket használunk a festéshez. Olvasztás után a sejteket 4 ml HBSS-ben vesszük fel. Homogenizálás után mintát veszünk, a sejtszuszpenziót centrifugáljuk 5 percig, 350 g fordulaton, 6 ºC-ra előre hűtött centrigufában, a kivett mintából Sysmex készülékkel sejtszámot határozunk meg. A centrifugálást követően a felülúszót leöntjük, a pelletet fellazítjuk, majd a kapott sejtszám alapján a sejteket PBS-ben vesszük fel úgy, hogy a végkoncentrációjuk 1*107/ml legyen. A jelölésre szánt sejteket üres csőbe pipettázzuk a sejtszuszpenzió homogenizálását követően. A sejteket CFSE festékkel festjük 1 mM koncentrációban. A sejteket sötétben, 20 percig, szobahőmérsékleten inkubáljuk, így a festék képes a sejtek citoplazmájába a membránon keresztül átjutni. Eközben a nem festett sejteket FACS segítségével mérjük (jelöletlen kontroll). Az inkubációt követően a sejtekhez hozzáadunk 4 ml komplett RPMI médiumot (RPMI; FBS good (10%); PEST (Penicillin-Streptomycin) (1%), Merck Life Science; Glutamax (1%), Gibco). Centrifugáljuk 5 percig, 400 g fordulaton, szobahőmérsékleten. A felülúszót leöntjük, a pelletet fellazítjuk és 4 ml komplett RPMI médiumban felvesszük a sejteket és újabb 20 perc inkubáció következik, ezúttal sötétben, 37ºC-on. Az inkubációs idő letelte után újból lecentrifugáljuk a sejteket 5 percig, 400 g fordulaton, szobahőmérsékleten, majd felvesszük őket komplett RPMI médiumban úgy, hogy a sejttenyésztő lemezre kihelyezéshez a megfelelő koncentrációban legyenek. A CFSE-vel jelölt sejteket is mérjük FACS-al, hogy megbizonyosodjunk a festés sikerességéről.
Perifériás mononukleáris sejtek proliferációjának detektálása
A kísérletben előre meghatározott inkubációs idő letelte után a sejteket megszámoljuk és a fent írtak szerint a megjelenített felhőképeken a limfocita és a proliferáló sejteket, illetve ezen belül az egyedi sejteket (singlet) kapuzzuk. CytExpert (Beckman Coulter) programban kiválasztjuk a „hisztogram” ábrázolási módot, ahol a sejtszámot (y-tengely) a CFSE-jel (x-tengely) arányában ábrázoljuk. Először egy kezeletlen kontroll mintán bejelöljük a P1 szakaszt mely a kiindulási CFSE-jeltől a csökkenő jelintenzitás irányába fedi le az x-tengelyt. Ezután minden lemért mintát kiértékelünk a P1 szakasz alapján, amely segítségével meg tudjuk mondani, hogy a mintában lévő proliferáló, egysejtek (singlet kapu) hány százalékában látható csökkenés a CFSE-jel intenzitásában, vagyis a sejtek hány százaléka osztódott. Az így leolvasott százalékos értékeket GraphPad Prism 9.1.2 (GraphPad) program segítségével ábrázoljuk.
Perifériás mononukleáris sejtek proliferáció gátlása mesenchymális őssejtekkel
A kísérletekhez mindig a laborban éppen elérhető a korábbi napokban tenyésztőedénybe kirakott és felszaporított MSC sejtvonalat használunk fel. A tervezésnél figyelembe vesszük, hogy az adott PBMC sejtszámhoz mennyi MSC sejtmennyiség szükséges. Az MSC sejteken lévő DLH médiumot (DMEM Low Glucose (Gibco), humán vérlemezke lizátum (HPL) (5%), Gentamicin (0,01%, Gibco), Heparibene Na 25000 injekció (1,5 U/mL végkoncentráció, Ratiopharm)) leszívjuk, majd hasonló mennyiségű PBS (Gibco) pufferrel átmossuk egyszer, hogy a sejtekről teljesen eltávolítsuk a sejttenyésztő médium maradékát is. Rámérjük a sejtekre a tenyésztő edény méretének megfelelő mennyiségű TrypLE (Gibco) enzim oldatot, ennek hatására az MSC sejtek feljönnek a tenyésztőedény felszínéről. Ezt a folyamatot 37 °C-on termosztátban tudjuk gyorsítani. Fénymikroszkóppal ellenőrizzük, hogy a sejteket sikerült-e a felszíntől elválasztani. Ha igen, akkor ezt követően M2 médiummal (500 mL HBSS (Gibco), HPL (2%), Gentamicin (0,01%), Heparibene Na 25000 injekció (1,5 U/mL végkoncentráció)) leállítjuk az enzimreakciót és a sejteket egy 15 ml-es centrifugacsőbe pipettázzuk, és a homogenizált szuszpenzióból mintát veszünk FACS-al történő sejtszám meghatározásra. A többi sejtet centrifugáljuk 7 percig, szobahőmérsékleten, 400 g fordulatszámon. Leöntjük a felülúszót, a pelletet fellazítjuk és a sejteket felvesszük DLH médiumban, a kísérlethez megfelelő koncentrációban.
Ezután a kísérleti tervnek megfelelően 96 lyukú sejttenyésztő lemezre helyezzük az MSC sejteket és a feljebb leírt módon CFSE-vel megjelölt PBMC sejteket. Abban az esetben, ha egy lyukba mindkét típúsú sejt belekerül, azokat közvetlenül egymás után helyezzük a lyukba nagyon kis időkülönbséggel és a sejteket összesen 200 µl-nyi médiumban tenyésztjük a továbbiakban. A megfelelő lyukakba belemérjük a PBS-ben 10x-re hígított Con A-t (0,8 µl /well) úgy, hogy a végkoncenrtáció 2 µg/ml legyen. Ezután a sejteket ellenőrizzük fénymikroszkóppal. A sejteket termosztátban tartottuk 37 °C-on, 5% CO2 koncentráción a kísérlet végéig.
Az inkubációs idő letelte után a sejtszuszpenziót CD markerekkel megjelöljük, majd áramlási citométerrel mérjük.
CD-marker festési protokoll
A sejtekhez sejtszámtól függetlenül (1-1*106 sejtmennyiségig) 1 µl-nyi ellenanyagot vagy ellenanyagokat pipettázunk. Húsz percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáljuk őket. Az inkubációs idő letelte után 0,5*106 sejtmennyiség alatt a sejteket az adott térfogatuk ötszörösére hígítjuk PBS-sel, és mérjük áramlási citométerrel.
Áramlási citométer: CytoFLEX, szoftver: CytExpert (Beckman Coulter)
Felhasznált ellenaynagok listája: anti-human-CD4-APC/Cy7 (Biolegend), anti-human-CD8-APC (Immumotools), anti-human-CD16-PE/Cy7 (Biolegend), anti-human-CD8-PE/Cy7 (Biolegend), anti-human-CD20-PE (Biolegend), anti-human-CD56-APC (Immunotools)