Általános információ
A kurzus vezetője: Dr. Csala Miklós egyetemi tanár, tanszékvezető
Semmelweis Egyetem Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, Molekuláris Biológiai Tanszék
Előadók: Dr. Csala Miklós, Dr. Hrabák András, Dr. Sipeki Szabolcs
Helyszín: Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományi Központ, Budapest, IX. Tűzoltó u. 37-47. Időpont: szerda 13.00-17.00 Hári Pál terem
Tematika:
- Nukleinsavak szerkezete.
A genetikai információ tárolása és kifejeződése. Az információ áramlásának iránya, a gén fogalma. Géncsaládok, szupergéncsaládok, génclusterek, genom változékonysága, szatellita DNS, non-repetitív gének – struktúrgének. A nukleotidok és a polinukleotid-láncok szerkezete, polaritása, 3′ és 5′ vég fogalma, a szekvencia jelölése, a DNS szerkezete, a komplementer láncokat összetartó kötések, a DNS denaturációja és a hibridizáció fogalma, DNS topoizomerek. Az RNS szerkezete, mRNS, tRNS, rRNS szerkezete. A prokarióta genom, az eukarióta genom és a vírus genom fogalma. A kromoszómák szerveződése, a ploiditás.
- A DNS replikációja.
A DNS replikáció elve. A topoizomerázok. A DNS-dependens-DNS polimerázok működése, templát, primer fogalma, a replikáció iránya, illetve a két lánc szintézisének iránya, a proofreading, az Okazaki-fragmentumok, a nick, a DNS-ligáz által katalizált reakció. A cirkuláris prokarióta genom replikációja, a replikációs origo, a plazmidok fogalma. A DNS replikációja eukarióta sejtekben. Az eukarióta kromoszóma szerveződése. Eukarióta DNS-polimerázok, a telomeráz.
- A DNS károsodásainak javítása repair mechanizmusok, mutációk.
A DNS leggyakoribb kémiai károsodásai, a bázisok dezaminációja, depurinizáció. Timin dimérek kialakulása. Timin-uracil helyett, biztonsági szerepe a DNS-ben. A DNS károsodások javításának mechanizmusai, a a repair rendszerek kapacitásának határa, a mismatch repair. A kijavítatlan károsodások rögzülése, mutációk. A pontmutációk kialakulásának mechanizmusai, a spontán mutáció mechanizmusa, a pontmutációk következményei kódoló DNS szakaszon, a frame shift illetve a nonsense mutáció fogalma. A mutációk következményei csírasejtekben és szomatikus sejtekben, szuppresszor mutáció. Az Ames próba.
- Az RNS és a transzkripció.
A gén és a transzkripció prokariótákban. A DNS-dependens-RNS-polimeráz működése, a gén orientációja a kódoló, sense (+) DNS-lánc és a templát (-) DNS-lánc fogalma, a prokarióta transzkripciós egység, a promoter (erős, gyenge), a konstitutív gének fogalma, a prokarióta mRNS szerkezete. A transzkripció és az RNS poszt-transzkripciós módosulásai eukariótákban. Az eukarióta DNS jellegzetességei, az eukarióta gén exon – intron szerkezete. Az eukarióta transzkripciós egység, az eukarióta RNS-polimerázok. A heteronukleáris RNS fogalma. Az mRNS érése, az 5′ – cap, a 3′ – poliA farok kialakulása, a splicing mechanizmusa. Az eukarióta mRNS szerkezete, az alternatív splicing.
- A génkifejeződés szabályozása, transzkripciós faktorok.
A transzkripció szabályozása prokariótákban, regulátor fehérjék, cisz és transz regulátor elemek. A laktóz (lac) -operon működésének negatív és pozitív szabályozása. A prokarióta riboszóma RNS és tRNS transzkripciója. A transzkripció szabályozása eukariótákban. A transzkripció iniciációjának szabályozása, általános és specifikus transzkripciós faktorok. A hisztonok és a DNS kovalens módosításának (acetiláció, metiláció) jelentősége. Magi (szteroid, tiroid) receptor géncsaládhoz tartozó transzkripciós faktorok. A miRNS szintézise, szerepe a génexpresszió szabályozásában.
- A vírusgenom replikációja és az onkogének.
A vírusgenom, a fágok replikációjának lítikus és lizogén útja, a fág represszor. A restrikciós endonukleázok. Az állati vírusok replikációs stratégiái. A kettős szálú RNS megjelenésének szerepe az interferonok hatásmechanizmusában. A DNS genommal rendelkező állati vírusok, kapcsolatuk a daganatképződéssel, a tumor szupresszor gének fogalma. A retrovírusok replikációja, a reverz transzkriptáz. Az onkogéneket hordozó retrovírusok, a protoonkogén és az onkogén fogalma, kapcsolatuk a daganatképződéssel.
- Fehérjeszintézis és lebontás.
A transzláció mechanizmusa és a polipeptidlánc további sorsa. A genetikai kód, a kódszótár, a transzlációs apparátus komponensei. A transzlációhoz szükséges sejtorganellumok és makromolekulák. A tRNS szerkezet és funkció kapcsolata, aminoacil-tRNS szintetázok. Az mRNS, a kodon-antikodon kapcsolat, a lötyögés biológiai jelentősége. Prokarióta és eukarióta riboszómák szerkezete és kötőhelyei. A polipeptidlánc szintézisének mechanizmusa. A transzláció folyamata prokariótákban és eukariótákban, a riboszóma ciklus, tRNS töltés, tRNS kötés, iniciáció, elongáció, a peptidkötés kialakulása, terminálás. A transzláció szabályozása, az eIF2 foszforilációja. A fehérje szintézist gátló antibiotikumok hatásmechanizmusa. A fehérjék sejtorganellumokba irányítása és a transzláció utáni módosulások. Szekréciós és membrán fehérjék szintézise, transzportja az ER membránon. Az ER és a Golgi rendszer szerepe a glikoprotein szintézisben. A fehérjék intracelluláris lebontása, a lizoszóma, az ubiquitin-proteaszóma rendszer.
- Molekuláris biológiai és egyéb biológiai laboratóriumi módszerek. Fizikai-kémiai és biológiai alapú elválasztási módszerek (elektroforézis, kromatográfia) alapelvei. Az enzimdiagnosztika alapjai. Makromolekulák szintézisének mérése jelzett prekurzorokkal. Immunológiai analitikai módszerek (Western-blot, ELISA, Proteome Profiler, AlphaLISA). Aptamerek, ELONA.
- Rekombináns géntechnológia. A DNS nukleotid-sorrendjének meghatározása (kémiai hasítás, Sanger-módszer, újgenerációs szekvenálások). Restrikciós enzimek, restrikciós endonukleázok gyakorlati jelentősége. Cinkujj-nukleázok. Molekuláris olló (CRISPR/Cas), DNS fragmentek elektroforézise – Restrikciós térképek. Hibridizáció – Southern blot, Northern blot, in situ hibridizáció, (immunhisztokémia). Genetikai rekombináció, integráció, mobil genetikai elemek, géntérkép. Rekombináns DNS vektorok – plazmid, fág, cosmid, YAC, expressziós vektorok. Vektor tervezés – példák: klónozás – szelekciót optimalizáló módszerek. Expressziós vektorok – prokarióta, eukarióta. Genom könyvtár: készítése, felhasználása – kromoszóma séta, génkeresés („screenelés”), cDNS könyvtár: készítése, felhasználása, teljes fehérje szekvencia megfejtése. DNS chip.
- Génamplifikációs eljárások. A polimeráz láncreakció elve, optimalizálása. Allél-specifikus PCR. Restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus – orvosi, igazságügyi, élelmiszer-biztonsági alkalmazások. A PCR orvosi alkalmazásai – virológia, prenatalis diagnózis mutációk kimutatására. Real-time PCR. Géndiagnosztika: Ismert genetikai mutációk, vírus nukleinsavak kimutatása (RFLP, ASA).
- A rekombináns géntechnológia gyakorlati alkalmazásai. A géntechnológia gyógyászati alkalmazása: rekombináns géntechnológiával előállított biológiai aktív anyagok (inzulin, véralvadási faktorok, antikoagulánsok, vakcinák). Mutagenezis. Génterápia, előnyei, hátrányai (ADA, TNF). Transzgenikus és knock-out állatok. Mikro-RNS-ek és jelentőségük. A génmódosított élelmiszerek problémája – előállításuk, egészségügyi, ökológiai és gazdasági kockázatok, a génmanipuláció törvényi korlátozása. A tudományos-technológiai fejlődés társadalmi következményei.
- A Humán Genom Project program. A humán genom szekvenálása, a gén-adatbankok hozzáférésének biztosítása és a genetikai adatok biztonságos kezelése. A HGP-t követő további projektek, és az eredményekből levonható általános biológiai következtetések. A szellemi tulajdonjog problémái a molekuláris genetikában.
- Bioinformatika. Az in silico vizsgálatok alapjai. DNS és fehérje szekvencia adatbankok, a Brenda enzimológiai adatbázis. Az adatbankok használata. Mycobacterium tuberculosis fertőzés és Leiden-mutáció PCR-azonosításához szükséges primer megtervezése DNS-adatbank segítségével. Nukleinsav- és fehérjehomológiák vizsgálata szekvencia adatbankok felhasználásával. Fehérjék térszerkezetének modellezése Rastop programmal.
- Rendszerbiológia. A hálózatelmélet alapfogalmai, skálafüggetlen hálózatok. Biológiai hálózatok. A betegségek hálózatelméleti megközelítése. Informatika és hálózatelmélet a gyógyszertervezésben. A szintetikus biológia alapfogalmai.
A kollokviumi felkészüléshez az alábbi forrásmunkák használandók:
– Ádám Veronika (szerk): Orvosi Biokémia, Semmelweis Kiadó, Bp. 2016, molekuláris biológiai fejezet
– Biokémia, Molekuláris és Sejtbiológia, egyetemi tankönyv (Szerk. Bánhegyi Gábor és Sipeki Szabolcs), e-jegyzet, 1. rész.
– Hrabák András: Molekuláris biológiai módszerek. Semmelweis Kiadó, e-jegyzet, 2018-as kiadás. Csak online változatban érhető el, további információk a „Letölthető anyagok” között.
– Az előadásoknak az tanszék honlapjára kerülő ábrái.
A korábban alkalmazott szintfelmérő tesztet a koronavirus-járvány idején az online oktatásban nem lehetett alkalmazni. A tesztet a járvány után sem állítottuk vissza, mivel azt korábban is csak kivételes esetben tudták megoldani. Helyette a félév elején két egyórás felzárkóztató előadást tartunk azoknak a diákoknak, akik nem kaphattak jegymegajánlást. Az előadások célja, hogy átismételjük azokat a gimnáziumban tanult kémiai és biokémiai fogalmakat, amelyek ismerete szükséges a molekuláris biológiai kurzus előadásainak megértéséhez, de amelyek azóta feledésbe merültek. Azok a hallgatók, akik MSc tanulmányaik során előbb tanulták a biokémiát, mint a molekuláris biológiát, kihagyhatják ezeket az előadásokat.
A felmentés szabályai
A molekuláris biológia tantárgy alóli felmentés általános szabályai (2022.)
A molekuláris biológia tantárgy alól felmentést kérő hallgatók számának növekedése és a tantárgy mesterképzésbe való átsorolása miatt szükségessé vált a felmentések világos normák szerinti szabályozása.
Mivel a BME Villamosmérnöki és Informatikai Kara (BME VIK) nem fogad el olyan tárgyakat MSc kurzuson, amelyeket kötelezően tanultak, a következő megoldást alkalmazzuk a felmentésre: a felmenthető hallgatók a szükséges dokumentumokat (diploma ill. azon tárgyak vizsgajegyeinek másolata, amelyek alapján a felmentést kérik) Dr. Hrabák Andrásnak küldjék el e-mailhez csatolva.
A megfelelő igazoló dokumentumok (egyetemi leckekönyv) bemutatása alapján a molekuláris biológia tananyagát tartalmazó tárgyak jegyeiből képzett átlaggal automatikusan felmentést (tehát jegymegajánlást) kapnak az orvostudományi egyetemek általános-, fogorvostudományi karain, valamint a Semmelweis Egyetem Gyógyszerésztudományi Karán a természettudományi karok biológus illetve biológia-kémia tanári szakjain a műszaki egyetemek vegyészmérnöki karának biomérnöki szakjain végzett hallgatók, amennyiben a végzés évétől számítva öt évnél több nem telt el.
A fenti szabályok mind az osztatlan, mind a kétciklusú alapképzésben résztvett hallgatókra érvényesek.
Az orvostudományi egyetemek gyógyszerésztudományi karai, valamint más egyetemek, karok, szakok „biológia”, „biokémia”, „molekuláris biológia”, „bio/géntechnológia” illetve „sejtbiológia” tárgyainak elvégzése esetén az elvégzést igazoló dokumentum (index) mellett be kell nyújtani az adott tantárgy(ak) részletes tematikáját, a felkészüléshez használt tankönyv(ek)/ jegyzet(ek) címét, a felmentés alapjául szolgáló tárgy heti óraszámát, kreditpont-értékét igazoló dokumentumot is. Ezekben az esetekben a felmentés a dokumentumok alapján egyéni mérlegelés alapján adható meg.
- A felmentett hallgatók molekuláris biológia érdemjegyét a felmentés alapjául szolgáló tárgy(ak) szigorlati (ennek hiányában záró kollokviumi) jegye(inek átlaga) alapján számoljuk ki. Felmentést (vagyis jegymegajánlást) csak közepes, vagy annál jobb eredmény alapján adunk!
- Amennyiben a diploma megszerzését követően 5 évnél több telt el, a tananyag avulása, változása miatt felmentés egyáltalán nem adható.
- Az említett eseteken kívül egyéni mérlegelés alapján felmentés adható azoknak a kérelmezőknek, akik igazolni tudják, hogy a jelentkezés idején legalább 5 éve folyamatosan molekuláris biológiai vagy olyan laboratóriumban dolgoznak, ahol maguk is rendszeresen használnak molekuláris biológiai módszereket. Az igazolást a laboratórium vezetőjének kell kiadnia és aláírásával hitelesítenie. A tantárgy jegyének megállapításához ebben az esetben is szükség van a korábbi érdemjegyet igazoló dokumentumra.
- Amennyiben a felmentett hallgató nem elégedett a korábbi tanulmányi alapján számított érdemjeggyel, lehetősége van a kurzus végén vizsgára jelentkezni jobb érdemjegy megszerzése érdekében.
Kollokviumi tételek
A molekuláris biológia elméleti alapjai
- A nukleinsavak alkotó elemei, a nukleotidok és a polinukleotid-láncok elsődleges szerkezete, polaritása.
- A nukleinsavak másodlagos és harmadlagos szerkezete. A DNS denaturációja, a hibridizáció.
- A gén, a pozitív (kódoló) és negatív (antisense) DNS szál fogalma. A prokarióta, az eukarióta és a vírus genom összehasonlítása.
- Az eukarióta genom elemei, kódoló, nem kódoló, egyedi és ismétlődő szekvenciák.
- Az eukarióta kromoszóma szerveződése, a ploiditás, a triszómia.
- A DNS replikációjának elve, a DNS-polimerázok általános tulajdonságai, a replikációs villa, az Okazaki fragmentumok, a gap és a nick fogalma, a DNS-ligázok. A DNS-topoizomerázok.
- A cirkuláris prokarióta genom replikációjának menete, a prokarióta DNS-polimerázok. A plazmidok.
- A DNS replikációjának menete eukarióta sejtekben, az eukarióta DNS-polimerázok. A telomeráz működése és jelentősége.
- A DNS replikáció hibajavító mechanizmusai prokariótákban és eukariótákban.
- A DNS károsodás, a replikációs hiba és a mutáció fogalma. A nukleotidok leggyakoribb kémiai károsodásai. A timin jelentősége a DNS-ben. A DNS károsodások javító mechanizmusai.
- A pontmutációk típusai, a kódoló régiókat érintő pontmutációk következményei, a szupresszor mutáció. Az Ames próba.
- A prokarióta transzkripciós egység, a promoter és funkciója, a konstitutív gének, a transzkripció menete prokariótákban, a prokarióta mRNS szerkezete.
- Az operon fogalma, a prokariota transzkripció negatív és pozitív szabályozása a lac-operon példáján.
- Az eukarióta gének szerkezete, a transzkripciós egység, az eukarióta RNS-polimerázok. Az eukarióta mRNS szerkezete, az 5′ – Cap, a 3′ – poliA farok kialakulása.
- Az eukarióta mRNS splicing mechanizmusa, lehetőségei és eredménye. A miRNS szintézise, szerepe a génexpresszió szabályozásában.
- A transzkripció szabályozása eukariotákban. Általános (obligát) és specifikus (génszelektív) transzkripciós faktorok, a hisztonok acetilációjának jelentősége. A magi receptorok családjába tartozó transzkripciós faktorok.
- A tRNS és az rRNS szerkezete, transzkripciója és érése eukariótákban, a nukleolusz. A prokarióta és eukarióta riboszómák szerkezete és kötőhelyei.
- A kódszótár, az aminoacil-tRNS szintetázok, a kodon-antikodon kapcsolat, a lötyögés biológiai jelentősége.
- A transzláció iniciációs szakasza prokariótákban és eukariótákban.
- A transzláció elongációs szakasza, terminálás. A fehérjeszintézis gátlószerei.
- Az eukarióta transzláció szabályozásának mechanizmusai.
- A fehérjék szortírozása a citoplazmába, a sejtmagba és a mitokondriumba. A citoplazmai fehérjék leggyakoribb poszt-transzlációs módosulásai.
- A fehérjék szortírozása az endoplazmás retikulumon, Golgi rendszeren keresztül, az N- és az O-glikoziláció.
- A lizoszóma saját fehérjéinek szintézise, a fehérjék lebontása a lizoszóma, illetve az ubiquitin-proteaszóma rendszer útján.
- A vírusok csoportosítása replikációs mechanizmusuk szerint. Az alfa és béta interferonok jelentősége.
- A fágok replikációjának litikus és lizogén útja, a fág represszor. A restrikciós endonukleázok.
- Az emberi DNS vírusok kapcsolata a daganatképződéssel, a tumor szupresszor gének fogalma.
- A retrovírusok replikációja, a reverz transzkriptáz.
- Az onkogéneket hordozó retrovírusok, a protoonkogén és az onkogén fogalma, kapcsolatuk a daganatképződéssel.
Molekuláris biológiai módszerek
- Az elektroforézis és a kromatográfiák alapelvei. Makromolekulák szintézisének mérése jelzett prekurzorokkal. Enzimek a diagnosztikában.
- A Western-blot és az ELISA alapelve és felhasználása. AlphaLISA módszer.
- Aptamerek és alkalmazásuk, ELONA. A spiegelmer-technika elve.
- Az áramlási citometria elve és felhasználása.
- A DNS bázisszekvenciájának meghatározási módszereinek elvi alapjai (kémiai hasítás – Maxam-Gilbert; megszakított enzimatikus szintézis – Sanger; új generációs szekvenálások – piroszekvenálás, ion-félvezetős szekvenálás)
- Restrikciós endonukleázok jellemzői. DNS fragmentek elektroforézise. Restrikciós térképek készítése.
- Hibridizációs módszerek – Southern blot, Northern blot, in situ hibridizáció
- A rekombináns DNS vektorok (plazmid, fág, cosmid, YAC) jellemzői, a vektor tervezés szempontjai.
- Génkönyvtárak. Genom könyvtár készítése, használata, gének azonosítása, kromoszóma séta, genom térképezési stratégiák. A cDNS fogalma, készítése, vektor konstruálása, a cDNS könyvtár jellemzői. EST könyvtárak.
- Helyspecifikus nukleázok (cinkujj- és meganukleázok)
- A CRISPR/Cas technológia alapelve és alkalmazási lehetőségei. „Gene drive”.
- Prokarióta expressziós vektorok, fúziós fehérjék, biológiailag aktív anyagok (inzulin, hormonok, véralvadási faktorok) előállítása géntechnológiával
- Expressziós vektorok eukariotákban, riporter gének.
- A polimeráz láncreakció elve, restrikciós fragmentum hosszúság-polimorfizmus (RFLP), allél-specifikus amplifikáció (ASA).
- A PCR orvosi-diagnosztikai, igazságügyi és élelmiszerbiztonsági alkalmazásai.
- A real-time PCR elve és felhasználása. Rekombináz polimeráz amplifikáció (RPA)
- A DNS-chip elve és alkalmazása a diagnosztikában.
- A mutagenezis főbb lehetőségei, kémiai mutagenezis, random és irányított mutagenezis
- Géntranszfer, transzgenikus állatok, knock-out állatok.
- A mikro-RNS-ek kialakulása, szerepe a sejtekben, illetve felhasználása géncsendesítésre.
- A Humán Genom Projekt és a hozzá kapcsolódó újabb humángenetikai vizsgálatok. Humán mutációk jelentősége a diagnosztikában és a terápiában. Az egyéni genetikai adatok védelmének jelentősége.
- A génterápia változatai és eddigi eredményei (TIL, ADA, cisztás fibrózis terápiái).
- A szintetikus biológia fogalma. Mycoplasma átprogramozása mesterséges genommal.
- Természetben nem létező nukleinsavak és fehérjék előállításának elvi alapjai.
- A molekuláris biológia internetes adatbázisai és használatuk (NCBI, Uniprot, Brenda, KEGG). Az adatbázisok szabad felhasználásának jelentősége.
- Orvosi és biológiai publikációs adatbázisok (Pubmed, Ovid, Scopus, Web of Science) és felhasználásuk a kutatásban. Az OMIM és jelentősége. A Magyar Tudományos Művek Tára. Az „Open access” fogalma.
- Mycobacterium tuberculosis és Leiden-szindróma kimutatására szolgáló primer internetes adatbázissal történő tervezésének szempontjai.
- Fehérjehomológiák keresése internetes adatbázisokkal. A homológiák felhasználása tudományos elemzésekben. Fehérje térszerkezetek modellezése.
- A rendszerbiológia alapfogalmai, skálafüggetlen hálózatok fogalma és tulajdonságai. Merev és rugalmas hálózatok. Poligénes öröklődésű betegségek kialakulásának elméletei. Az inzulin, mint elágazó hálózati kiindulópont.
- Hálózatok megzavarása – betegségek. A hálózatkutatás és gyógyszertervezés kapcsolata, különös tekintettel a daganatterápiára (irányító mutációk jelentősége). Gyógyszercélpontok előrejelzésének alapelvei.
- A génmódosított növények előállítása, termesztése, engedélyezése.
- A génmódosított növények termesztésének kockázatai, egy-egy példával.
- A molekuláris biológia ökológiai vonatkozásai. A mikrobiom/mikrobiota fogalma. Az ökológiai egyensúly jelentősége, az ökológiai lábnyom fogalma, Gaia-elmélet.
A vizsgán minden vizsgázó 1-1 tételt húz a két kérdéscsoportból, valamint otthon kidolgoz egy előzetesen kiválasztott bioinformatikai feladatot.
A felkészüléshez ajánlott irodalom:
- Ádám V. (szerk.): Orvosi Biokémia (2001, illetve 2016).
- Bánhegyi G., Sipeki Sz. (szerk.): Biokémia, molekuláris és sejtbiológia (I. rész)
- Hrabák András: Molekuláris biológiai módszerek elvi alapjai és gyakorlati felhasználásuk. E-jegyzet, Semmelweis Kiadó, 2018.
- Pusztai-Bardócz: A genetikailag módosított élelmiszerek biztonsága (interneten ingyen olvasható, itt: http://mek.oszk.hu/03200/03216/html/
- Darvas Béla blogja: génmódosítással és orvosi-táplálkozási témákkal foglalkozó írások: https://darvasbela.atlatszo.hu/
- A Molekuláris Biológiai Tanszék honlapján található előadási anyagok; a jelszóval a BME-kurzuson kívül az SE kurzus letölthető anyagai is használhatók (ezek a Molekuláris sejtbiológia I. letölthető anyagai között találhatók meg).