Betűméret: A A A

In vitro szívizom sejtkultúra vizsgálatok

Az izolált szívizomsejtek kiváló lehetőséget nyújtanak számos, a szívet érő káros hatás tanulmányozására, például a miokardiális iszkémia vizsgálatára. A szív, mint pumpafunkciót ellátó szerv in vivo stressz behatásnak való kitétele esetén (in vivo) nehézséget jelenthet a szervezet egészét érintő faktorok kizárása. Ilyen esetben az intakt szívizom vizsgálata és következtetések levonása akadályokba ütközhet. A sejt kultúrában tartott szívizom sejtek jó lehetőséget kínálnak az adott sejttípus direkt vizsgálatára más sejt típusok kizárásával. Ezentúl a tenyésztett sejtek könnyűszerrel alávethetők vizsgálatoknak (pl.: gyógyszerek hatásának tanulmányozása) a tenyésztési környezet megváltoztatásával (Vander Heide et al. 1990).

Neonatális patkány szívizom sejtkultúra

A neonatális szívizomsejt/kardiomiocita modell lehetővé teszi a szívizom morfológiai, biokémiai és elektrofiziológiai karakterisztikájának vizsgálatát. A modellen változatos kísérleti metodikák alkalmazhatóak, így kontrakciós vizsgálatok, iszkémia, hipoxia, továbbá toxicitás vizsgálatok.

A neonatális szívizomsejteken spontán kontrakciós aktivitás jelenik meg a tenyésztés második, harmadik napjára. Ez lehet egyéni sejtek spontán aktivitása, vagy clusterbe rendeződő összehúzódások.

Alkalmazásuk széleskörben elterjedt, mivel izolálása és fenttartása egyszerűbb, mint a felnőtt állatokból izolált szívizomsejtek esetében. Ezen sejtek a neonatális periódusban genetikai manipulációra alkalmasak.

Limitációt jelenthet a számos a felnőtt szívizom sejtekre jellemző tulajdonság hiánya.

Felnőtt patkány szívizomsejt kultúra

A felnőtt, fiatal állatokból származó differenciált szívizomsejtek rúd formájúak és jól szervezett, fénymikroszkóppal vizsgálható kontrakciós rendszert tartalmaznak. Egészséges sejtek rendszeresen spontán kontrahálnak a tenyészetben, illetve elektromos impulzusok hatására irányítható kontrakciós tevékenységük.

A primer felnőtt kardiomiociták lehetőséget adnak a szívbetegségek celluláris és molekuláris modellezése, mivel hasonló a morfológiájuk, biokémiájuk és viselkedésük az intakt szövetekben lévő kardiomiocitákhoz.

Azonban vannak hátrányaik is. A felnőtt kardiomiociták morfológiája és funkcionális jellemzői idővel változhatnak a tenyészetben, ezért az izolálást követően csak rövid távon fenntarthatók.

Primer mikrovaszkuláris endoteliális sejtek

A szívizmot behálózó kapillárisok falát alkotó sejtek és a szív izomsejtjei között aktív két oldalú kapcsolat van. Ezáltal az endoteliális sejtek állapota, károsodása kihathat a szívizom károsodására, azt súlyosbíthatja. Ezzel párhuzamosan ezen endotél sejtek szabályozzák a kapillárisok áteresztő képességét, ezáltal a károsító hatásra kialakuló szívizom ödéma mértékét.

Laborunkban felnőtt patkányokból származó primer endotheliális sejteket izolálunk és tenyésztünk. Emellett rendelkezésre álnak egyéb endotél sejtvonalak melyek humán eredetűek (HUVEK).

Szimulált iszkémia/reperfúziós kísérleti elrendezés

Iszkémia-reperfúziós kísérleteinkben lehetőség nyílik a szívinfarktus során lejátszódó változások in vitro körülmények közti modellezésére. Ehhez az iszkémia idejére a rendszert elzárjuk az oxigéntől, ezzel a sejteket hipoxiának tesszük ki. Továbbá a sejtek tápoldatát lecseréljük, ezzel modellezve az iszkémia során létrejövő tápanyaghiányt.

Az iszkémiát modellünkben szimulált reperfúzió követi. Ennek során a sejtek mind tápanyag dús környezetét, mind a normál oxigén ellátásukat helyreállítjuk. Ezen fázis kulcsfontosságú mivel a reperfúzió pillanatában további, az iszkémia károsító hatásához hozzáadódó, sejt károsodás lép fel.

Modellünkben nagy áteresztő képességgel, alacsony költség és munkaigény mellett lehetséges gyógyszerek iszkémiás károsodásra kifejtett hatásának tesztelése. Továbbá modellünk kiegészíthető egyes társbetegségek (hiperglikémia, hiperkoleszterinémia) szimulálásának beépítésével.

Iszkémia/reperfúziós károsodás csökkentése mikroRNS-ek modulációja által

Elméleti háttér:

A mikroRNS-ek rövid (~22 nukleotid), nem kódoló RNS molekulák, melyek a gén kifejeződés poszttranszlációs szabályozói (1). Egy adott mikroRNS számos mRNS-t célozhat, eltérő mértékben befolyásolva azok élettartamát, degradációját (2-3).

Ezek a mikroRNS-ek alapvetően befolyásolják a szív fehérje expressziós mintázatát. Korábbi kutatásainkban kimutattuk, hogy bizonyos mikroRNS-ek fokozott (microRNA-139-5p, microRNA-125b*) vagy csökkent (microRNA-487b) expressziója, iszkémia elleni védelmet hoz létre kardiomiocitákban. Ezek alapján feltételezhető, hogy a mikroRNS-eknek szerepe lehet más kardioprotektív eljárásokban is. (4).

Továbbá a mikroRNS-ek és az általuk szabályozott fehérjék interakciós hálózata lehetőséget nyújt az adott kórállapot, pl: a hiperkoleszterinémia hatására kialakuló elváltozások szabályozási pontjainak azonosításában.

Jelen kutatásaink célja olyan mikroRNS-ek azonosítása patkányban és sertésben, melyek klinikailag releváns kardioprotektív eljárásokban (pl. iszkémiás posztkondícionálás, távoli iszkémiás perkondícionálás) játszanak szerepet. Ezentúl eredményeinkből kiindulva megkezdjük egy jövőbeli mikroRNS-moduláción alapuló terápiás eljárás fejlesztését.

Témacsoport vezető: Prof. Ferdinandy Péter, Dr. Görbe Anikó, Dr. Makkos András

Témában korábban megjelent cikkek:

  • Ágg B, Baranyai T, Makkos A, Vető B, Faragó N, Zvara Á, Giricz Z, Veres DV, Csermely P, Arányi T, Puskás LG, Varga ZV, Ferdinandy P. MicroRNA interactome analysis predicts post-transcriptional regulation of ADRB2 and PPP3R1 in the hypercholesterolemic myocardium. Sci Rep. 2018 Jul 4;8(1):10134. (link)
  • Varga ZV, Ágg B, Ferdinandy P. miR-125b is a protectomiR: A rising star for acute cardioprotection. J Mol Cell Cardiol. 2018 Feb;115:51-53 (link)
  • Varga ZV, Zvara A, Faragó N, Kocsis GF, Pipicz M, Gáspár R, Bencsik P, Görbe A, Csonka C, Puskás LG, Thum T, Csont T, Ferdinandy P. MicroRNAs associated with ischemia-reperfusion injury and cardioprotection by ischemic pre- and postconditioning: protectomiRs. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014 Jul 15;307(2):H216-27. (link)
  • Varga ZV, Kupai K, Szűcs G, Gáspár R, Pálóczi J, Faragó N, Zvara A, Puskás LG, Rázga Z, Tiszlavicz L, Bencsik P, Görbe A, Csonka C, Ferdinandy P, Csont T. MicroRNA-25-dependent up-regulation of NADPH oxidase 4 (NOX4) mediates hypercholesterolemia-induced oxidative/nitrative stress and subsequent dysfunction in the heart. J Mol Cell Cardiol. 2013 Sep;62:111-21 (link)
  • Faragó N, Zvara A, Varga Z, Ferdinandy P, Puskás LG. Purification of high-quality micro RNA from the heart tissue. Acta Biol Hung. 2011 Dec;62(4):413-25. (link)

A témában TDK hallgatók által elért eredmények:

  • Nabil Sayour TDK hallgató, Semmelweis Egyetem Tudományos Diákköri Konferencia, Kardiológia szekció I. hely (2018)

Elsajátítható képességek: primer neonatális kardiomiocita izoláció, sejtkultúra fenntartása, liposzómás transzfekciós rendszer, fluoreszcens végpontmérések, Wester blot, RT-PCR

Társbetegségek és rejtett kardiotoxicitás vizsgálatok izolált szívizomsejteken

Elméleti háttér:

Az iszkémia/reperfúzió okozta miokardiális károsodás jelentősen fokozott lehet társbetegségek és azok rizikófaktorainak jelenlétében, mint amilyen a hiperkoleszterinémia vagy a hiperglikémia. Továbbá ezen társbetegségek gátolhatják a kardioprotektív eljárások, például az iszkémiás prekondicionálás hatékonyságát. A hiperkoleszterinémiás állapot in vitro modellezése (a szívizom lipidome-jának in vivo megváltozását követve) kardiomiocita sejt kultúra modellben jól reprezentálhatja a hiperkoleszterinémiás miokardiumot. Az így létrehozott közepes áteresztő képességű in vitro tesztrendszerben vizsgálhatjuk a miokardiális iszkémia/reperfúziós károsodás és a hiperkoleszterinémia együttes hatását

Ezen modell rendszerben szintén lehetőség van nagy áteresztőképesség mellett tesztelni egyes gyógyszerek ún. rejtett kardiotoxicitását.

A gyógyszerek súlyosbíthatják az iszkémia/reperfúziós károsodás mértékét és a társbetegségek által kiváltott sejthalál-, és proaritmiás mechanizmusokat, gátolhatják a kardioprotektív útvonalak aktiválását. A gyógyszerek ezen tulajdonságaira azok biztonságosságának nem klinikai vizsgálatakor (preklinikai fázis) nem derül fény, ezért ezt a jelenséget rejtett kardiotoxicitásnak nevezhetjük. A rejtett kardiotoxicitás kiszűrésére jelen pillanatban nem áll rendelkezésünkre megfelelő eszköz, így indokoltak azon jelenlegi kutatásaink, melyek a gyógyszerek rejtett kardiotoxikus tulajdonságainak lehető legkorábbi hatékony kiszűrésének új lehetőségeit vizsgálják. A rejtett kardiotoxicitás korai kiszűrése a gyógyszer fejlesztésének felfüggesztését eredményezheti, amivel jelentős anyagi és emberi erőforrás takarítható meg és megóvhatjuk a betegeket potenciálisan toxikus szerek használatától.

Témacsoport vezető: Dr. Görbe Anikó

Témában korábban megjelent cikkek:

  • Andreadou I, Iliodromitis EK, Lazou A, Görbe A, Giricz Z, Schulz R, Ferdinandy P. Effect of hypercholesterolaemia on myocardial function, ischaemia-reperfusion injury and cardioprotection by preconditioning, postconditioning and remote conditioning. Br J Pharmacol. 2017 Jun ;174(12):1555-1569. (link)
  • Varga ZV, Kupai K, Szűcs G, Gáspár R, Pálóczi J, Faragó N, Zvara A, Puskás LG, Rázga Z, Tiszlavicz L, Bencsik P, Görbe A, Csonka C, Ferdinandy P, Csont T. MicroRNA-25-dependent up-regulation of NADPH oxidase 4 (NOX4) mediates hypercholesterolemia-induced oxidative/nitrative stress and subsequent dysfunction in the heart. J Mol Cell Cardiol. 2013 Sep;62:111-21. (link)
  • Csont T, Bereczki E, Bencsik P, Fodor G, Görbe A, Zvara A, Csonka C, Puskás LG, Sántha M, Ferdinandy P. Hypercholesterolemia increases myocardial oxidative and nitrosative stress thereby leading to cardiac dysfunction in apoB-100 transgenic mice. Cardiovasc Res. 2007 Oct 1;76(1):100-9. (link)
  • Ferdinandy P. Myocardial ischaemia/reperfusion injury and preconditioning: effects of hypercholesterolaemia/hyperlipidaemia. Br J Pharmacol. 2003 Jan;138(2):283-5. (link)
  • Ferdinandy, P. et al., Definition of hidden drug cardiotoxicity: paradigm change in cardiac safety testing and its clinical implications.Eur Heart J, 2018. (link)
  • Ferdinandy, P., et al., Interaction of risk factors, comorbidities, and comedications with ischemia/reperfusion injury and cardioprotection by preconditioning, postconditioning, and remote conditioning.Pharmacol Rev, 2014. 66(4): p. 1142-74. (link)

Altémák:

  • Hiperkoleszterinémia és hiperglikémia in vitro sejtkultúra modelljei

Elsajátítható képességek: primer neonatális és felnőtt kardiomiocita izoláció, sejtkultúra fenttartása, fluoreszcens végpontmérések, Wester blot, PCR

Témavezető: Dr. Makkos András, PhD hallgató

  • In vitro sejtkultúra rejtett kardiotoxicitás vizsgálatok

Elsajátítható képességek: primer neonatális és felnőtt kardiomiocita izoláció, sejtkultúra fenttartása, fluoreszcens végpontmérések, Wester blot, PCR

Témavezető: Kis Bernadett, PhD hallgató