Betűméret: A A A

MedInProt Munkacsoportok

Szinergia I.

Szabályozó fehérjék szerepe az öregedési folyamat(ok)ban
Kutatók: Vellai Tibor, Bánhegyi Gábor, Sőti Csaba

Bemutatás

Az Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet ER redox laboratóriumának kutatási területe az endoplazmás retikulum (ER) redox homeosztázisának vizsgálata. A MEDinPROT projekt (“Szabályozó fehérjék szerepe az öregedési folyamatban”) keretében a mobilis genetikai elemek (Vellai csoport), az autofágia és az ER stressz-válasz (Bánhegyi csoport ), valamint a hő-sokk fehérje rendszer (Sőti csoport) aktivitását szabályozó fehérjék közti funkcionális összefüggéseket igyekszünk feltárni. Az autofágia, ER stressz és hő-sokk protein rendszerek egyes elemeinek életkorfüggő aktivitásának nyomon követésével természetes, korral járó csökkenésük észlelhető. Azt feltételezzük, hogy a mobilis genetikai elemek fokozatosan növekvő aktivitása (figyelembe véve, hogy az emberi genom mintegy felét ezek a mobilis genetikai elemek képezik) a szomatikus genomban felelős az öregedési folyamatért a transzpozon mutagenezis révén.

 

Egy újonnan felfedezett gyulladáskeltő folyamat nyomában
Kutatók: Gál Péter, Cervenak László, Pál Gábor

Bemutatás

A gyulladásos megbetegedések súlyos egészségügyi problémát jelentenek, kezelésükre sok esetben nem áll rendelkezésre megfelelő terápia. Ennek az az oka, hogy sokszor nem ismerjük a gyulladás kialakulásának pontos mechanizmusát és a potenciális gyógyszercélpont molekulákat sem. Az MTA-TTK szerkezeti biofizika munkacsoportjának és a Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika kutatólaboratóriumának együttműködésében felfedeztünk egy új, potenciálisan jelentős, gyulladáskeltő mechanizmust. Kimutattuk, hogy a vérben található MASP-1 proteáz, a komplementrendszer lektin útjának indító enzime képes endotélsejteket aktiválni. A MASP-1 ebben az esetben hormonszerűen működik; egy sejtfelszíni (G-fehérje kapcsolt) receptorral kölcsönhatva külső jelet (pl. sérülés, idegen sejtek jelenléte) közvetítenek a sejt belseje felé. Ezekkel a kutatásokkal párhuzamosan az ELTE Biokémiai Tanszékén a természetben nem található, szelektív gátlószereket fejlesztettünk ki a lektin út enzimei ellen. A szinergia program keretén belül a három kutatócsoport közös erőfeszítéseket tesz az újonnan azonosított gyulladáskeltő folyamat mind alaposabb feltárására. Fő kérdésünk, hogy vajon az említett jelátviteli folyamat révén megváltozik-e az endotélsejtek adhéziós-molekula mintázata. Ez ugyanis előfeltétele annak, hogy a gyulladásban résztvevő fehérvérsejtek kilépjenek az érpályából. Ehhez kapcsolódva azt is vizsgáljuk, hogy a MASP-1-aktivált endotélsejtek és a neutrofil granulociták között kialakul-e megfelelő erősségű, extravazációt lehetővé tévő adhézió.

 

Extracelluláris vezikulák komplementrendszerrel való kölcsönhatásának vizsgálata
Kutatók: Buzás Edit Irén, Józsi Mihály

Bemutatás

Az extracelluláris vezikulák foszfolipid kettősréteggel határolt, a sejtek által aktívan, evolúciósan konzervált módon szecernált szubmikron képletek. Az extracelluláris vezikulák (exoszómák, mikrovezikulák és apoptotikus testek) átjuthatnak vér-szöveti barriereken, és az eddigi adatok szerint fontos tényezők lehetnek számos betegség kialakulásában. Az extracelluláris térbe kerülve ezek a vezikulák kölcsönhatásba léphetnek a szervezet különböző sejteivel és molekuláival, köztük az ún. komplementrendszerrel. A komplementrendszer a szervezet egyik legalapvetőbb, számos szolubilis fehérjét tartalmazó védelmi rendszere, mely a veleszületett immunitás részét képezi. Több évtizede ismert, hogy a komplementfehérjék számos megbetegedés kialakulásának fontos szereplői. Tervezett vizsgálatainkkal arra a kérdésre keresünk választ, hogy az egyes extracelluláris vezikula típusok aktiválnak-e komplementet, milyen komplement fehérjéket kötnek, valamint a komplement- és komplementgátló fehérjék extracelluláris vezikulák felszínéhez történő kötődése milyen funkcionális következménnyel jár, pl. gyulladásos tünetek kialakulása szempontjából. Az együttműködő kutatócsoportok közül a SE Buzás Edit vezette munkacsoportja rendelkezik az extracelluláris vezikulák izolálásának és vizsgálatának state-of-the-art eszköztárával. Ennek a módszertani és műszerháttérnek az egyesítése a kutatási projekt során az MTA-ELTE Józsi Mihály vezette komplement munkacsoportjának eszköztárával lehetőséget teremt a komplement fehérjék extracelluláris vezikulákkal való kapcsolatának első szisztematikus, artefaktumokat kizáró vizsgálatára.

 

Szinergia II.

A jelátviteli utakban bekövetkező változások szerepe a rosszindulatú tumoros sejtek energia háztartására
Kutatók: Ambrus Attila, Győrffy Balázs, Hauser Péter, Tretter László

Bemutatás

Normális sejtek anaerob körülmények között beindítják a glikolízist – Warburg már 1930-ban megfigyelte, hogy a tumoros sejtek ezt aerob körülmények között is megteszik. Ez az ún. „aerob glikolízis” teszi lehetővé, hogy a gyors sejtosztódáshoz szükséges makromolekulák azonnal rendelkezésre álljanak. Hasonló jelenséget a gyorsan osztódó embrionális sejtekben is megfigyeltek. A folyamat mögötti „driver” gének között van a GLUT1, amelyik a folyamathoz szükséges extra glukóz sejtbe történő felvételét fokozza valamint a HIF1a és HIF2a transzkripciós faktorok, amelyek több gén szabályozásán keresztül a glikolízis beindításáért felelősek. Az energia metabolizmus átalakulása a rosszindulatú tumorok kialakulásával összefüggésbe hozott hat ismertetőjeggyel (onkogén aktiváció, tumorszuppresszorok kikapcsolása, osztódási halhatatlanság, apoptózis-elkerülés, érújdonképződés, áttétképzés) szorosan összefügg, ami felveti, hogy nem ezektől független, hanem az ezekben résztvevő gének által irányított folyamatról (!) van szó. A tervezett kutatás koncepcionális alapja, hogy feltételezzük, hogy a jelátviteli útvonalakban leggyakrabban megjelenő „driver” mutációk befolyásolják, hogy az aerob glikolízis és a citrátkör milyen szerepet fog játszani az adott tumor energia háztartásában. Ezért egy újszerű megközelítést alkalmazunk, amelyben a glikolízishez kapcsolódó gének vizsgálatát egyes mutációkat tartalmazó klinikai csoportokon belül végezzük el. A vizsgálataink során tehát nem maga a glikolízis/mitokondriális oxidáció vagy a mutáció a fő téma, hanem a kettő kombinációja. A korábban folytatott leíró jellegű bioinformatikai elemzéseken túlmutatva jelen projekt azt teszi lehetővé, hogy ne csak megváltozó géneket azonosítsunk, de az anaerob glikolízis vizsgálatán keresztül a tumoros progresszió molekuláris alapjait is jobban megértsük.

 

Immunsejtek adhéziójának vizsgálata
Kutatók: Kellermayer Miklós, Sándor Noémi, Székács Inna, Szabó Bálint

Bemutatás

Három különböző, egymást kiegészítő vizsgálati módszert vetünk be a humán monociták, makrofágok és dendritikis sejtek vizsgálatára. Ezek a nagy áteresztőképességű jelölésmentes optikai bioszenzor (Corning EPIC), a számítógép-vezérelt mikropipetta (CellSorter) és a teljes visszaverődésen alapuló fluoreszcens mikroszkóp (TIRFM). A három technika közös tulajdonsága, hogy az optikailag hozzáférhető síkfelületen kitapadó élő sejtek vizsgálatára képesek. A fehérjeszintű specificitást az EPIC és a számítógép-vezérelt mikropipetta esetében a felület biokémiai kezelése (bevonása) adja. Az EPIC feladata a sejtadhézió kinetikájának nagy felbontású monitorozása. TIRF mikroszkóppal a sejtadhézióban résztvevő intracelluláris fehérjék lokalizációját követjük az immuncitokémiai jelölés elvégzése után különböző időpontokban fixált sejteket vizsgálva. A számítógép-vezérelt mikropipettával az egyedi sejtek adhéziós erejét nN mértékegységben tudjuk nagy pontossággal meghatározni. A három technikát az integrin alegységeket kódoló RNS csendesítése és ellenanyaggal történő receptor blokkolást követően is bevetjük. Az így nyert eredmények összegzésével egy új biofizikai modellt készülünk felállítani, ami számot ad a leukociták integrin-függő adhéziójának időbeli lefolyásáról.

 

Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos eNOS és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal
Kutatók: Benyó Zoltán, Liliom Károly

Bemutatás

Kutatásaink célkitűzése a vérkeringési rendszer molekuláris szabályozási mechanizmusainak integratív (szubcelluláris, sejt-, szövet- és szervezet szintű) megismerése. Ennek során egyszerre törekszünk az élettani folyamatok részletes vizsgálatára és a működésükben beálló zavarok feltárására egyes kórállapotokban (pl. diszlipidémia, diabetes, agyi trauma és stroke). Vizsgálatainkban egyaránt alkalmazunk modern farmakológiai és gén-manipulációs technikákat azzal a céllal, hogy a szabályozási folyamatok normális és kóros működését feltárva elméleti alapot szolgáltassunk a fent említett kórképekben tapasztalható vérkeringési zavarok új terápiás lehetőségeinek kidolgozására.
Főbb kutatási módszerek: Klasszikus és szövet-specifikus kondicionális gén-deléciós állatmodellek, szöveti véráramlás-mérés lézer-speckle és lézer-Doppler módszerrel, izolált erek válaszkészségének vizsgálata, humán és egér endothelium sejtkultúra, intracelluláris Ca2+-szint meghatározása fluoreszcens festékekkel, génexpresszió analízis immunhisztokémiával, Western-blottal és RT-PCR módszerrel.

 

A mitokondriális DNS mutációk hatása az oxidatív fehérje foldingra és a gyógyszertoxicitásra
Kutatók: Mandl József, Szarka András

Bemutatás

A mitokondriális DNS (mtDNS) mutációk mértéke jelentős mértékben megnő az életkor előrehaladtával, amely mitokondriális diszfunkcióhoz vezethet. A mitokondriális kaszkád hipotézis értelmében, az egyén genetikai háttere meghatározza a mitokondriális funkcióját és annak tartósságát. Ez végső soron meghatározza az egyén korfüggő mitokondriális hanyatlási rátáját. Amikor a mitokondriális funkció egy bizonyos szint alá süllyed, akkor jelenik meg számos, az idős korra jellemző elváltozás. Az öregedés tanulmányozásához elengedhetetlen a mtDNS mutációkkal rendelkező citoplazmatikus hibrid sejtvonalak létrehozása, amely pályázatunk egyik központi eleme. A sejtvonal segítségével vizsgálni kívánjuk az oxidatív fehérje folding folyamatát. Az oxidatív fehérje folding végső elektronfelvevője a mitokondriális elektron transzfer lánc, így az idősebb korban/mtDNS defektus esetén alacsonyabb hatásfokkal működhet. Az öregedéssel együtt járó mitokondriális funkcióváltozás befolyásolhatja a gyógyszer biotranszformációt illetve a gyógyszermolekulák biotranszformációja perturbálhatja mind az ER, mind mitokondriális redox viszonyokat. Ezért ezen folyamatok egymásra gyakorolt hatását is meg kívánjuk vizsgálni a létrehozott cibrid vonalakon.

 

KRAS mutációk hatása tumorsejtek kollektív migrációjára és inváziójára
Kutatók: Czirok András, Tímár József

Bemutatás

Az emberi rosszindulatú daganatok egyik, ha nem a leggyakoribb onkogén hibája a KRAS mutáció. A legtöbb növekedési faktor jelpályában kulcsszereplő a RAS jelszabályozó/erősítő rendszer, ezért a KRAS mutációkat hordozó daganatok általában sokkal agresszívebbek és a hagyományos terápiára kevésbé érzékenyek. A mutáns RAS a klasszikus RAS-RAF-MAPK útvonal mellett a PI3K-AKT, a PLC-PKC és a JAK-STAT jelpályákat is képes ellenőrzés alá vonni. A SE és ELTE kutatócsoportjainak együttműködése a tumorbiológia és jelátviteli patológia területén természetes módon egészíti ki egymást: a modellrendszerek kialakításával és molekuláris biológiai tesztelésével egyik (SE) oldalról, a jelpályák aktivitásának funkcionális vizsgálatával, a kollektív sejtmozgás paramétereinek meghatározásával a másik (ELTE) oldalról. A vizsgálatok célja a KRAS allélspecifikus mutációinak és funkcionális heterogenitásának pontos jellemzése. A KRAS mutáció hatását csoportos sejtmozgásra, sejtadhézióra és invázióra in vitro imaging kísérletekkel, és egyedi sejt-követő technikákkal határozzuk meg. A különböző jelpályák szerepét specifikus gátlószerekkel vizsgáljuk. A project eredményei potenciálisan klinikailag hasznosíthatóak és lehetővé tehetik egy, a mutáns RAS változatok hatását korrigáló hatóanyag tervezését.

 

A podocin patogenitása, dimerizációja és térszerkezete közötti kapcsolat
Kutatók: Harmat Veronika, Karancsiné Menyhárd Dóra, Tory Kálmán

Bemutatás

A szteroid-rezisztens nefrózis szindróma (SRNS) a krónikus veseelégtelenség egyik leggyakoribb oka gyermekkorban. Az SRNS esetek 12-18%-áért a podocint kódoló NPHS2 gén mutációi felelősek. A podocin a podocita-résmembrán alkotóeleme, és mint a sztomatin-család tagja, ismert, hogy dimer alapú oligomereket képez. Korábban kimutattuk, hogy az NPHS2 hipomorf variánsnak tartott R229Q polimorfizmusa csak akkor patogén, ha bizonyos 3’ misszensz mutációkkal társul a másik szülői allélon. Ezen transz-asszociációk kóros dimerképződéshez és a podocin sejten belüli diszlokalizációjához vezetnek. Epidemiológiai adatok alapján egy 3’ trunkáns mutáció (F344Lfs*4) szintén patogén társulást képez az R229Q variánssal. Jelen munkánk célja ezen trunkáns mutáció podocin-lokalizációra gyakorolt hatásának megértése más 3’ trunkáns mutációk hatásával összevetve. A trunkáns mutációk és asszociációik podocin-lokalizációra gyakorolt hatását podocita-kultúrán tranziens expresszióval vizsgáljuk. A podocin térszerkezetét Pyrococcus hirokoshii stomatin kristályszerkezete alapján modellezzük, és elméleti módszerekkel vizsgáljuk az egyes variánsok szerkezetét és dimerképzési hajlamát. Az egyes variánsok dimerizációért felelős szakaszainak oldatbeli viselkedését kromatográfiás módszerek, valamint CD- és NMR-spektroszkópia segítségével kívánjuk jellemezni, hogy feltételezéseinket alátámaszthassuk. A podocin teljes, C-terminális intracelluláris doménjének expresszióját és tisztítását tervezzük, hogy elegendő mennyiségű fehérje álljon rendelkezésre a podocin kristályosításához és szerkezetmeghatározásához. Mindezek alapján a dimerképződés, a sejten belüli delokalizáció és a klinikum kapcsolatát szeretnénk megérteni.